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中科院天津所張學禮團隊一年三叩Metabolic Engineering

發布時間:2018-01-05被瀏覽次數:


      導語:代謝工程是目前合成生物學主要方向之一,研究的主要思路是對工業微生物進行系統分析和整體改造,以達到高產產物的目的。Metabolic Engineering是該領域的Top級雜志。中科院天津所張學禮團隊在代謝工程領域也是一支優秀的團隊。


1. 在染色體多基因同時編輯技術

      理性設計了CRISPR/Cas9輔助的染色體多基因同時編輯技術(見下圖)。該系統由三個質粒組成:質粒IpRBSL-genes)含有待調控的多個基因的調控文庫元件及其同源臂;質粒IIpRedCas9)含有Cas9基因及重組酶Red;質粒IIIpgRNA-genes)提供多基因的引導gRNA,引導Cas9在正確的基因上切割。使用這三個質粒,通過兩次轉化和兩次誘導,能在染色體上快速實現多個基因的同時文庫調控,操作周期為4天。使用這一策略,對木糖代謝途徑中四個基因(xylAB, tktAtalB)的表達同時進行了調控,基因同時編輯的效率達到70%;快速獲得了木糖代謝速率提高的多基因編輯菌株,木糖代謝速率提高了3倍。該研究對代謝工程和合成生物學中的途徑優化有很大的促進作用。(PMID28800965


CRISPR/Cas9多基因編輯系統

a)基于M1-93人工啟動子設計RBS庫,下劃線顯示RBS區域。紅色表示用于構建供體DNA質粒對引物接頭(b)供體DNA質粒RBS庫構建。使用pHomo-genesDNA為模板擴增出三個含有RBS庫的基因片段,用Golden-gate技術組裝。(c)代謝途徑目標基因的調控過程。共轉化Cas9質粒和供體DNA質粒,在阿拉伯糖的誘導下,供體DNA發生同源重組;再轉化gRNA質粒,誘導Cas9切割非同源重組菌株,實現代謝途徑多基因調控。(d)代謝途徑多基因編輯步驟。

2. 在膜改造提高萜類化合物合成方面

      萜類化合物是天然產物的典型代表,有廣泛的醫療保健作用和巨大的經濟價值。構建微生物細胞工廠合成高附加值萜類化合物是代謝工程的研究熱點。目前在提高微生物細胞工廠合成萜類化合物方面的改造策略主要集中在對關鍵蛋白進行改造以及對代謝途徑進行精確調控,然而從細胞性能方面對細胞工廠進行改造的報道較少。萜類化合物通常是疏水化合物,它在細胞中的積累機制也沒有深入的研究和明確的結論。研究了大腸桿菌細胞膜改造對提高萜類化合物合成能力的影響。研究結果顯示,通過引入單葡萄糖甘油二酯合成酶Almgs將β-胡蘿卜素的單位細胞含量提高了70%,并進一步增強了細胞膜主要成分甘油磷脂的合成途徑,將β-胡蘿卜素的單位細胞含量提高了2.9倍(由6.7 mg/g細胞干重提高至19.6 mg/g細胞干重)(見下圖)。同時,在膜工程改造的大腸桿菌細胞的電鏡圖像中觀察到向內的膜堆積,表明膜形態變化與β-胡蘿卜素儲存容量相關。膜分離和分析實驗證實,增加的β-胡蘿卜素主要集中在細胞膜部分。膜工程策略也適用于β-胡蘿卜素高產菌株,使其產量提高了39%(由31.8 mg/g細胞干重提高至44.2 mg/g細胞干重),是目前報道的相同培養條件下的最高產量之一。本研究闡明了疏水萜類化合物在細胞內的積累機制,并為創建高產疏水化合物的細胞工廠提供了全新的改造思路。(PMID: 28688931


膜改造提高萜類化合物積累與合成

3. 在萜類化合物合成方面

      類胡蘿卜素是一類代表性的萜類化合物,包括番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素等。中科院天津工業生物技術研究所張學禮研究員帶領的微生物代謝工程研究團隊前期在改造大腸桿菌生產類胡蘿卜素方面有較好的研究基礎,一方面通過對中央代謝途徑的系統改造提高ATPNADPH供給,解決萜類化合物合成途徑中輔因子不足的問題(Metab Eng, 2013);另一方面,通過細胞膜形態和細胞膜合成的改造提高大腸桿菌的細胞膜含量,解決萜類化合物在底盤細胞中的存儲問題(Metab Eng, 2017)。萜類化合物的通用前體合成途徑有兩條,一條是MEP途徑,另一條是MVA途徑,這兩條途徑都能提供萜類化合物最關鍵的前體代謝物異戊烯焦磷酸(IPP)。大腸桿菌自身含有MEP途徑,早期的研究發現dxsidi兩個基因是MEP途徑中的關鍵限速因子,然而目前對其它相關基因的研究較少,MEP途徑中是否存在其它的限速因子還不清楚。本研究系統研究了MEP途徑中其它5個基因(dxr, ispD, ispE, ispGispH)的表達量和β-胡蘿卜素產量之間的相互關系。通過構建啟動子文庫分別調控這5個基因,研究細胞生長、β-胡蘿卜素產量及代表性菌株相應基因的轉錄水平,發現ispG基因表達量與細胞生長以及β-胡蘿卜素產量呈反比關系(見圖)。MEP途徑中間代謝物濃度測定發現IspG活性過高會導致其催化產物HMBPP積累;過表達ispG下游的ispH基因可以避免HMBPP積累,解除生長抑制,并將β-胡蘿卜素產量提高73%。轉錄組分析發現HMBPP積累會導致核酸和蛋白合成相關的基因顯著下調,表明HMBPP是有毒的中間代謝物。該研究表明ispGispHMEP途徑中另一個重要的限速步驟,它們需要協同表達才能發揮作用。本研究進一步明確了MEP途徑的調控機制,對構建高產萜類化合物的細胞工廠具有普適意義。(PMID: 28864262


中間代謝物HMBPP濃度和細胞生長以及β-胡蘿卜素產量呈反比關系


來源:中科院天津所、中國合成生物學

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